丙酮酸鈉對紅細胞氧化損傷的保護作用及其機制研究

紅細胞(red blood cell,RBC)作為機體血液的主要細胞組分,其主要功能是運輸O2和CO2。紅細胞結構的特殊性使其較其他細胞更易遭受自由基攻擊,發生氧化損傷。首先,紅細胞膜富含不飽和脂肪酸;其次胞內的主要成分是血紅蛋白,富含鐵,而鐵是催化自由基反應的有效劑;最后,紅細胞無線粒體,細胞核等細胞器使其發生損傷后無修復能力。紅細胞發生氧化損傷后結構功能均會發生變化。首先,ROS會攻擊紅細胞胞內的主要成分--血紅蛋白,使其氧化,轉變為高鐵血紅蛋白(Methehemoglobin,Met Hb),紅細胞失去攜氧能力影響組織氧供;同時血紅蛋白氧化會使珠蛋白交聯形成二硫鍵,沉積在細胞膜內側,影響膜流動性。其次,ROS攻擊紅細胞膜,會使膜脂質過氧化,膜蛋白交聯,最終導致膜流動性降低,硬度增加從而降低紅細胞變形性?？偠灾?ROS攻擊會破壞紅細胞的結構和功能。在多種生理病理條件下紅細胞都易發生氧化損傷。如運動性氧化應激會引起紅細胞氧化損傷,降低血液供氧能力,加深組織缺氧從而影響機體的運動能力和恢復過程;體外接觸過多的氧化劑,如鐵氰化合物或苯胺顏料等會使血紅蛋白氧化,形成高鐵血紅蛋白癥,影響組織氧供;輻射引起體內自由基增多,紅細胞膜脂質發生過氧化,滲透性增強,最終會導致溶血。由此可見紅細胞氧化損傷引起的結構功能變化會對機體產生一定的危害,其防治十分必要。目前常使用抗氧化劑對氧化損傷進行防治。常用的抗氧化劑包括內源性抗氧化劑(如維他命E、維他命C等)和外源性抗氧化劑(主要是植物提取物,如紅景天、復方天葡片等)。由于機體內存在許多自由基反應形態,自由基間可以轉換,單一的自由基清除劑如VE、Vc等不能有效的阻斷多態鏈式反應。植物提取物,如紅景天等療效確切,但作為外源性抗氧化劑,植物提取物作用緩慢,通常需要在發生氧化損傷前使用至少5天,有時甚至需要使用長達20天,這種緩慢的作用機制限制了它們在抗紅細胞急性氧化損傷上的使用。另外,植物提取物的成分不單一,對提取工藝要求較高,并且其作用機理較為復雜。因此我們期望尋找一種內源性的、成分單一的小分子化合物,用于紅細胞氧化損傷防治。丙酮酸鈉(sodium pyruvate,SP)是丙酮酸的鈉鹽。丙酮酸是一種內源性的小分子化合物,是糖代謝途徑中的關鍵中間產物,處于有氧代謝和無氧代謝的交匯處,可以進入三羧酸循環,代謝終產物是二氧化碳和水,也可以在無氧酵解中被轉變為乳酸。丙酮酸鈉本身具有抗炎、抗氧化、多器官保護和糾正酸中毒等作用。研究表明,丙酮酸鈉在失血性休克液體復蘇、腦損傷和缺血再灌注損傷模型中能夠保護器官功能,同時改善機體或器官氧化應激狀態;另外丙酮酸鈉在防治糖尿病引起的白內障、保護胰島細胞避免鋅中毒損傷等許多與氧化損傷密切相關的疾病治療中也取得一定成效。但是其對紅細胞氧化損傷保護作用至今未有報道。值得注意的是,使用含有丙酮酸鈉的復壯液對儲存血進行洗滌,發現能夠恢復紅細胞ATP水平,改善紅細胞功能。綜上所述,丙酮酸鈉既是能量代謝底物同時具有抗氧化的作用,針對紅細胞特殊的結構,我們認為其對紅細胞氧化損傷能起到更好的保護作用。因此本研究擬在體外建立合適的紅細胞氧化損傷模型,研究丙酮酸鈉對紅細胞氧化損傷的保護作用,并對其保護作用機制進行探討。第一部分:建立和篩選合適的紅細胞氧化損傷模型采用大鼠紅細胞建立氧化損傷模型,并對吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、亞硝酸鈉(sodium nitrite,Na NO2)等三種氧化劑的作用效果進行篩選。頸動脈采集大鼠血液,離心去除白細胞,獲得紅細胞重懸液后分為四組:對照組;PMS組(終濃度為25、50和100μM);H2O2組(終濃度為0.5、5和8 m M);Na NO2組(終濃度為0.5、1和1.5 m M)。其中,H2O2組中還需加入終濃度為0.4 m M疊氮化鈉(sodium azide,Na N3)溶液以防止加入的過氧化氫被酶解。37°C水浴1h,用自體血漿調節紅細胞壓積至40%,測定紅細胞氧化損傷的主要指標Met Hb含量以及聚集性、變形性等血液流變學指標。結果表明:三種氧化劑作用紅細胞后,與基礎值相比Met Hb含量均顯著升高(P0.05),說明三種氧化劑均使紅細胞產生一定程度的氧化損傷。在紅細胞聚集指數方面,H2O2組隨濃度升高呈下降趨勢,并在濃度為8 m M時與對照組相比具有統計學差異(P0.05);各濃度的PMS和Na NO2對紅細胞聚集指數均無明顯影響(P0.05)。在紅細胞聚集時間上,與對照組相比,H2O2作用濃度為5 m M和8 m M時聚集時間明顯升高(P0.05);PMS對聚集時間無明顯影響;Na NO2作用后聚集時間降低(P0.05),但隨著作用濃度升高聚集時間呈回升趨勢,在濃度為1.5m M時與對照組比無統計學差異。在紅細胞變形性方面,H2O2和PMS作用紅細胞后,不同剪切速率(shear rate,SHR)下的紅細胞變形性與對照組相比均顯著下降(P0.05);Na NO2作用紅細胞后,SHR≤100 s-1時,變形性降低(P0.05),但隨著SHR的增大,紅細胞變形性有升高趨勢,SHR≥600 s-1時,Na NO2組變形性顯著高于對照組(P0.05)。小結:Met Hb含量和紅細胞變形性等流變學指標是評價紅細胞氧化損傷的相關指標,其中Met Hb含量反應胞內血紅蛋白的狀態,與紅細胞攜放氧能力相關,紅細胞變形性等流變學指標與膜氧化后流動性相關。本部分研究結果顯示:三種氧化劑作用紅細胞均能引起Met Hb水平升高,證明其均造成一定程度的氧化損傷。但是三種氧化劑對紅細胞流變學特性影響大不相同,其中Na NO2可上調紅細胞變形能力,這可能與其作為NO供體的特性有關。由此可見Na NO2作為氧化劑一方面可使紅細胞Met Hb含量升高,造成紅細胞氧化損傷;但另一方面,它又可改善紅細胞變形能力,對紅細胞起雙向調節的作用,其機制較為復雜,因此我們認為Na NO2誘導的紅細胞氧化損傷模型不適用于后續的研究,故選擇PMS和H2O2作為主要氧化劑進行后續的紅細胞氧化損傷模型制備。另外根據Met Hb含量確定后續研究中PMS作用濃度為50μM,H2O2作用濃度為8 m M。第二部分:丙酮酸鈉對紅細胞氧化損傷的保護作用應用第一部分篩選的氧化劑種類及濃度建立紅細胞氧化損傷模型,并驗證丙酮酸鈉對紅細胞氧化損傷的保護作用。頸動脈采集大鼠血液,離心去除白細胞,獲得紅細胞重懸液。首先對丙酮酸鈉作用濃度進行篩選(分組為5、10、20、50和100 m M),通過作用前后Met Hb、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)等的變化確定丙酮酸鈉合適的作用濃度。隨后觀察不同濃度丙酮酸鈉對紅細胞的保護作用。將紅細胞重懸液分為兩組:PMS模型組和H2O2模型組。其中每一模型組又設置不同的作用條件,包括:對照組、氧化損傷組、丙酮酸鈉不同濃度預處理組等。首先向丙酮酸鈉預處理組加入相應濃度丙酮酸鈉,37°C作用30 min,隨后根據分組加入相應氧化劑于37°C作用1h。檢測相關指標變化,其中PMS組檢測指標包括Met Hb、MDA、GSH、GSH/GSSG比率和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR);H2O2組檢測指標有Met Hb、MDA、GSH。結果表明:不同濃度丙酮酸鈉作用紅細胞后,Met Hb無明顯升高,與對照組比無顯著差異(P0.05);MDA隨作用濃度升高明顯下降(P0.05),但在丙酮酸鈉為100 m M時回升;GSH含量隨作用濃度升高呈上升趨勢,但與對照組相比無顯著差異(P0.05),在丙酮酸鈉為100 m M時有所下降。結果提示,低濃度丙酮酸鈉對紅細胞無明顯副作用,100 m M的作用濃度下各指標異常提示可能該濃度偏高。故確定丙酮酸鈉作用濃度為5、10、20、50 m M。使用篩選的濃度觀察丙酮酸鈉對紅細胞氧化損傷的保護作用。結果表明PMS作用紅細胞后,與對照組相比,Met Hb、MDA含量升高(P0.05),GSH、GSH/GSSG下降(P0.05),GR無明顯變化(P0.05)。丙酮酸鈉預處理可以顯著降低PMS誘導的MDA水平,且在濃度為20 m M和50 m M時與PMS損傷組相比具有統計學差異(P0.05);還可升高GSH/GSSG比率,并呈劑量效應關系,各個濃度處理后GSH/GSSG比率與PMS損傷組相比均具有統計學差異(P0.05);但丙酮酸鈉預處理對PMS引起的Met Hb和GSH變化無明顯影響(P0.05)。H2O2作用紅細胞后,與對照組相比,Met Hb、MDA顯著升高(P0.05),GSH顯著下降(P0.05)。丙酮酸鈉預處理可以顯著降低H2O2誘導的Met Hb和MDA水平,與H2O2損傷組相比均具有統計學差異(P0.05);同時能升高GSH水平,在丙酮酸鈉濃度為20 m M和50 m M時,與H2O2損傷組比具有統計學差異(P0.05)。

小結:通過實驗選擇丙酮酸鈉作用濃度為5、10、20、50 m M進行保護作用研究。丙酮酸鈉均能夠降低PMS和H2O2誘導的MDA含量,表明丙酮酸鈉對這兩種氧化劑造成的紅細胞氧化損傷均具有一定程度保護作用;但是丙酮酸鈉對PMS誘導的Met Hb升高無明顯影響,卻能降低H2O2誘導的Met Hb水平,這可能與兩種氧化劑不同的作用機制有關,這也提示我們丙酮酸鈉在H2O2引起的紅細胞氧化損傷模型中保護作用較明顯。因此,在后續的實驗中選用H2O2誘導的氧化損傷模型研究丙酮酸鈉對紅細胞保護作用的機制。第三部分:丙酮酸鈉對紅細胞氧化損傷的保護作用機制探討以H2O2造成的紅細胞氧化損傷模型為主要研究對象,探討丙酮酸鈉對紅細胞氧化損傷保護作用的機制。頸動脈采集大鼠血液,離心去除白細胞,獲得紅細胞重懸液。將紅細胞重懸液分為:對照組,即沒有任何處理;H2O2損傷組,即只進行氧化損傷誘導;保護組,即采用不同濃度丙酮酸鈉預處理后再誘導氧化損傷,丙酮酸鈉作用濃度分別為5、10、20、50 m M。首先向保護組加入相應濃度丙酮酸鈉,37°C作用30 min,隨后向損傷組和保護組加入H2O2,于37°C作用1 h。檢測相關指標變化,包括ROS生成量,紅細胞功能指標P50,糖代謝指標2,3-DPG(2,3-diphosphoglycerate)、ATP水平和Na+-K+ATP酶活力以及代謝關鍵酶乳酸脫氫酶(lactate dehydrohenase,LDH)活力。結果表明:與對照組相比,H2O2作用紅細胞后,ROS水平上升,2,3-DPG和P50下降,ATP含量下降,Na+-K+ATP酶和LDH活力受到抑制(P0.05)。丙酮酸鈉預處理可以減少ROS含量,在濃度為50 m M時與損傷組比有統計學差異(P0.05);與損傷組相比,丙酮酸鈉濃度為10 m M和20 m M時可明顯恢復LDH活性(P0.05);各個濃度丙酮酸鈉預處理均可升高ATP水平(P0.05);濃度為20 m M和50 m M的丙酮酸鈉可明顯恢復Na+-K+ATP酶活力(P0.05),升高2,3-DPG水平(P0.05),還可提高P50(P0.05)。小結:首先,丙酮酸鈉能夠抑制ROS生成,直接降低H2O2對紅細胞的損傷;其次,丙酮酸鈉能夠提高LDH活力,促進紅細胞糖酵解途徑,恢復ATP水平,減輕紅細胞氧化損傷。丙酮酸在轉換為乳酸的過程中能夠升高NAD+/NADH,NAD+升高有助于2,3-DPG生成,因此我們認為丙酮酸鈉可促進2,3-DPG支路進行,提高2,3-DPG產量。作為糖酵解途徑中一個側支循環的產物,2,3-DPG是調節血紅蛋白攜放氧功能的重要因素。2,3-DPG可與脫氧血紅蛋白結合,降低血紅蛋白對O2的親和力,增加氧的釋放。本實驗也表明丙酮酸鈉預處理能夠升高2,3-DPG含量,從而升高P50,改善紅細胞功能,發揮紅細胞保護作用。丙酮酸鈉對紅細胞不同的糖代謝途徑起效濃度不一致,可能與各途徑在細胞中所占比例不同有關。綜上所述,本研究結果表明丙酮酸鈉對紅細胞的氧化損傷具有保護作用,并且其可分別通過調節糖酵解途徑及2,3-DPG支路,改善紅細胞功能、減輕紅細胞氧化損傷。本研究可為紅細胞氧化損傷相關疾病的防治提供新的思路和理論基礎。

克拉瑪爾試劑tel: 4001650900