整合蛋白β1在藻藍蛋白抑制白血病細胞系K562細胞增殖中的作用

 

作者：牛志云，潘崚，劉英杰，張學軍，索曉慧

【摘要】  　　本研究觀察不同濃度藻藍蛋白（phycocyanin）對K562細胞增殖的影響，并檢測藻藍蛋白處理后細胞表面整合蛋白β1表達和胞內黏著斑激酶（FAK）基因表達的變化，探討整合蛋白β1在藻藍蛋白抑制K562細胞增殖中的可能作用機制。用流式細胞術（FCM）檢測藻藍蛋白處理前后K562細胞表面整合蛋白β1表達變化；MTT法測定不同濃度藻藍蛋白對K562細胞增殖的影響；RT-PCR檢測不同濃度藻藍蛋白對K562細胞內FAK基因表達的作用。結果表明：整合蛋白β1在K562細胞上高表達；藻藍蛋白不能改變其表達量。不同濃度藻藍蛋白對K562細胞的增殖均有抑制作用。藻藍蛋白可上調胞內FAK的基因表達水平，恢復整合蛋白β1介導的細胞增殖抑制信號。結論：藻藍蛋白可能通過增強細胞基質與K562細胞表面的整合蛋白β1結合，上調K562細胞內FAK基因表達水平，恢復整合蛋白β1介導的細胞增殖抑制信號而發揮抑制K562細胞增殖的作用。

【關鍵詞】  藻藍蛋白；整合蛋白；白血病； K562細胞； 細胞增殖

　　Effects of Integrin β1 on Phycocyanin Inhibiting  Proliferation of K562 Cells 
Abstract    This study was purposed to investigate the effect of phycocyamin at different concentration on proliferation of K562 cells，to detect the changes of  integrin β1  expression and intracellular focal adhesion kinase (FAK) gene expression on the surface K562 cells treated with phycocyanin，and to explore the possible machanism of integrin β1  effect on phycocyanin inhibiting proliferation of K562 cells.   The expression level of integrin β1 on the surface of K562 cells was evaluated by flow cytometry (FCM);  the growth of K562 cells treated with phycocyanin was measured by MTT  assay; the expression level of FAK  mRNA was analyzed by relatively quantitative RT-PCR after four-day culture of K562 cells with phycocyanin  of 40 μg/ml，80 μg/ml and 160  μg/ml，respectively. The results showed that integrin β1 expression on the surface of K562 cells was significantly higher than that in bone marrow mononuclear cells (BMMNC) from normal subjects.  Phycocyanin could not change the level of integin β1  expression.  Phycocyanin could increase the expression of FAK gene on K562 cells and inhibit the proliferation of K562 cells.  It is concluded that  phycocyanin can inhibit the proliferation of K562 cells through  enhancing the conjunction of cell stroma with integrin  β1  on K562 cell surface，up-regulating the expression level of FAK gene in K562 cells，restoring the signaling pathway of proliferation inhibition mediated by integrin  β1.  The possible mechanism of phycocyanin in the proliferation inhibition of K562 cells is to increase the expression of FAK gene.  The phcocyanin may be considered as a potential agent for inhibition of cancer cell proliferation.

　　Key words    phycocyanin; integrin;  leukemia;  K562 cell; cell proliferation

    藻藍蛋白（phycocyanin）是螺旋藻中的一種有效成分，可提高機體的免疫力，抵抗疾病的發生［1］。研究發現，藻藍蛋白對體外培養的HeLa、HL-60、K562以及U-937等細胞的生長有較強抑制作用［2］，但其抑制細胞生長的作用機制尚不清楚。

    慢性粒細胞白血病（CML）患者體內存在的CML ph+細胞可異常增殖并逃避凋亡。研究證實，CML ph+細胞的這些特點與整合蛋白β1介導的黏附及增殖抑制功能存在障礙密切相關［3］。近年來研究表明，整合蛋白β1活化抗體8A2可明顯改善CML ph+細胞的黏附功能；干擾素可通過降低ph+細胞內整合蛋白信號通路中的黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的過度磷酸化，增加正常功能狀態的FAK含量，增強整合蛋白介導的增殖抑制作用［4，5］。本研究以慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞為研究對象，通過檢測藻藍蛋白對K562細胞的增殖影響，并觀察整合蛋白β1在此過程中所發揮的作用及FAK基因表達的改變，探討藻藍蛋白是否通過恢復整合蛋白β1的功能而發揮其抑制腫瘤細胞增殖作用的。

　　材料和方法

　　細胞系與試劑

　　CML急變期細胞系K652細胞由河北醫科大學細胞生物教研室惠贈，正常人的骨髓單個核細胞（BMMNC）和CML急變期病人BMMNC采自臨床標本。鼠抗人整合蛋白β1單克隆抗體和羊抗鼠熒光抗體FITC購自蘇州Coulter公司。胎牛血清、RPMI 1640培養液和四甲基偶氮唑藍（MTT）購于華美公司。藻藍蛋白由衡水博生生物公司惠贈，用前以無菌三蒸餾水稀釋成所需濃度。小鼠IgG同型對照抗體購自鼎國生物公司。TRIZOL  RNA提取液、隨機引物、M-MLV逆轉錄酶及TaqDNA聚合酶、dNTP等PCR反應體系均購自華美生物工程公司。FAK引物由Primer 5.0軟件設計，北京賽百盛基因技術有限公司合成。

　　懸浮培養模型的建立

　　K562細胞置于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于37℃、5％ CO2及飽和濕度下培養。取對數生長期細胞，以5×106／ml細胞接種于24孔板。藻藍蛋白終濃度分別為40 μg/ml、80 μg/ml和160 μg/ml。

　　K562細胞整合蛋白β1表達水平的流式細胞術測定

　收集對數生長期細胞并調整細胞密度為5×106／ml，取細胞懸液100 μl，一組加10 μl抗整合蛋白β1（CD29）單克隆抗體，另一組加小鼠IgG為同型對照，輕微混勻，4℃避光放置30分鐘；離心去上清，用冷PBS洗滌2遍，去除多余抗體；分別加入羊抗鼠FITC二抗10 μl 及冷PBS 100 μl，吸打混勻，4℃避光放置30分鐘；用冷PBS洗滌后將細胞重懸于200 μl冷PBS中，混勻并移至流式專用管內，應用FACS Calibur流式細胞儀檢測整合蛋白β1表達陽性的細胞率，應用CellQuest軟件分析數據。

     不同濃度藻藍蛋白對K562細胞增殖影響的MTT比色法測定

    取對數生長期的濃度為5×106／ml的K562細胞懸液，按每孔1 ml接種到24孔平底培養板中，設3個藻藍蛋白濃度實驗組（40 μg/ml組、80 μg/ml組、160 μg/ml組），每組各設6個平行孔，連續培養1-6天后進行檢測。從24孔板中每孔移取50 ml細胞液于96孔板的相應孔中，另外設陰性對照組。于培養結束前4小時在96孔板中每孔加入1 0 μl MTT溶液（5 mg/ml），離心棄上清，加入200 μl DMSO，充分溶解結晶物，然后用酶標儀測490 nm處吸光度A值，繪制細胞生長曲線。細胞增殖抑制率＝（1－處理組A值／對照組A值）×100％。

 RNA提取和濃度測定

　　分別離心收集各組K562細胞，用TRIZOL抽提總RNA。用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的RNA的完整性并觀察其降解情況，在紫外分光光度儀上測定RNA樣品A260 和A280比值。再用DEPC水將各組總RNA調整至同一濃度。

　　各組K562細胞內FAK mRNA表達水平的RT-PCR檢測

　　20 μl逆轉錄體系中含50 μg/ml隨機引物1 μl，5×逆轉錄反應緩沖液4 μl，10 mmol/L dNTP  2 μl，50 U/μl  RNasin 0.5 μl，M-MLV逆轉錄酶15 U，余用DEPC水補足20 μl。于37℃、60分鐘逆轉錄2 μg總RNA中的mRNA為cDNA，95℃ 反應5分鐘后終止反應。使用50 μl反應體系同時擴增目的基因和GAPDH基因，具體循環參數如下： 94℃預變性2分鐘進入循環，94℃變性40秒，54℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，經40個循環擴增后72℃延伸10分鐘。GAPDH基因上游引物：5’-CGGGAAGCTTGTGATCTT TGG-3’； 下游引物：5’-GGCATGGATGGCATGGACTGA-3’；引物擴增片段長度為358 bp。FAK上游引物：5’-TTGCGGAGAATATGGCTGACCTAA-3’； 下游引物：5’-TGGTATTGATGGCAAAGCCCGTTC-3’； 引物擴增片段長度為116 bp。取10 μl  RT-PCR產物及10 μl  DNA marker進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，采用MULIT IMAGE凝膠圖像分析儀進行吸光度掃描，觀察條帶的灰度強弱，結果以目的基因與GAPDH的積分吸光度的比值表示。

　　統計學處理

　　數據均以均數±標準差（ X±SD）表示，利用SPSS 10.0軟件進行統計分析。多組間均數差異性比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中LSD檢驗，P＜0.05即認為有統計學意義。

　　結果
 
K562細胞高表達整合蛋白β1

　　經FCM測定，正常人BMMNC和K562細胞整合蛋白β1(CD29)陽性表達率分別為72.40±3.56%和99.24±0.52%，后者較前者明顯增高（P<0.05）。CML急變期病人BMMNC整合蛋白β1陽性表達率為93.43±1.67%，較正常人組顯著增加（P<0　05）。這些結果表明，K562細胞和CML病人BMMNC整合蛋白β1表達升高。藻藍蛋白處理后K562細胞整合蛋白β1陽性表達率與未處理組比較無明顯改變（圖1）。

　　藻藍蛋白抑制K562細胞增殖
  
MTT檢測結果顯示，各濃度藻藍蛋白處理組的K562細胞增殖抑制率較對照組均顯著升高（P<0.01），并呈劑量依賴性的變化；且以藻藍蛋白孵育4天對K562細胞增殖的抑制作用最明顯，40、80和160μg/ml組第4天細胞抑制率分別為24.76％±4.96％、37.95％±5.13％和46.61％±2.64％（附表）。Tabel . Inhibition rate of phycocyanin （PC）  with  different concentrations on K562 cells analyzed by MTT test （略）

　　各組K562細胞的總RNA提取和鑒定

　　各組總RNA用紫外分光光度儀測定其A260 和A280 比值，結果顯示比值均在1.8-2.0范圍，證實了總RNA的完整性。1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見5S、18S、28S  3條特征帶，且28S條帶含量約是18S條帶的2倍，上樣孔周圍無明顯EB染色出現，表明無降解和DNA污染，純度附合要求。

　　藻藍蛋白對K562細胞內FAK mRNA表達水平的影響

　　檢測結果如 圖2所示，各組PCR產物條帶的FAK/GAPDH光密度比值分別為：0.40（對照組）、0.88（40     μg/ml組）、1.03（80 μg/ml組）、0.91（160 μg/ml組）和1　36（正常人BMMNC）。與正常人BMMNC比較，K562細胞內FAK基因表達明顯降低；不同濃度藻藍蛋白處理4天后K562細胞內FAK基因表達明顯增加，但各濃度組間無劑量依賴性。

　　討論

　　藻藍蛋白是螺旋藻的重要組分之一。研究表明，藻藍蛋白有較高的生理活性和藥用價值，如防治腫瘤，提高機體免疫力，促進動物血細胞再生等［6］。本實驗再次證實了藻藍蛋白抑制腫瘤細胞生長的作用。我們發現，藻藍蛋白對人白血病細胞株K562細胞增殖的抑制作用與細胞表面的整合蛋白β1的功能相關。為了闡明其作用機理，我們做了進一步研究。

    FCM結果顯示，在CML急變期病人的BMMNC和K562細胞表面整合蛋白β1均高表達，而藻藍蛋白并不改變其表達量。業已證明，整合蛋白β1的高表達與CML祖細胞中的P210融合蛋白的刺激有關，且P210蛋白對其正常信號的轉導有抑制作用。此外，Lundell等［7］通過克隆形成實驗發現，ph+細胞的整合蛋白介導的生長抑制信號轉導功能存在缺陷。因此我們推測，藻藍蛋白可能通過改善整合蛋白β1的功能缺陷，而非改變其表達量發揮作用。為了證實這一點，我們檢測了藻藍蛋白處理組K562細胞內FAK的基因表達水平。

    眾所周知，FAK處于整合蛋白信號通路與生長因子信號通路的交匯點，在生長因子受體系統與整合蛋白協同調節細胞的活化、增殖、凋亡等活動中發揮重要作用［8］。它是一種胞內非受體型酪氨酸蛋白激酶，參與了細胞內多種信號轉導途徑，并在信號轉導中起承上啟下的作用［9］。RT-PCR檢測結果表明，K562細胞與正常人BMMNC相比，FAK基因表達水平明顯降低。藻藍蛋白處理后K562細胞內FAK基因表達水平顯著增加。因此我們推測，藻藍蛋白可能通過抑制P210融合蛋白誘導FAK發生過度磷酸化，提高胞內具有正常功能的FAK表達量和活性，而恢復整合蛋白β1信號通路對CML ph+細胞增殖的負調控。此結果與常鉉等［5］的實驗結果一致，從而證實恢復整合蛋白β1對CML ph+細胞的增殖抑制功能是治療CML的有效途徑之一。同時本研究也證明，藻藍蛋白的確有抗腫瘤的功效，是一種很有開發潛力的藥物。

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