雞蛋白提取液對體外培養(yǎng)干細胞蛋白的影響(生物科學(xué)論文)

搞要 摘要:發(fā)現(xiàn)一種提取液能促進體細胞向干細胞轉(zhuǎn)變將在再生醫(yī)學(xué)研究中 有重要的意義，下 面是小編搜集整理的一.篇探究雞蛋白提取液對體外培養(yǎng)千 細胞蛋白影響的論文范文，歡迎閱讀參考。有文獻報道動物的卵細胞提取液 能重新編程體細胞，包括豬的卵細胞1和非洲爪蟾的

關(guān)鍵字:蛋白, 提取,體外,培養(yǎng),干細胞,白的，影響,發(fā)現(xiàn), - -種,提取

 發(fā)現(xiàn)一種提取液能促進體細胞向干細胞轉(zhuǎn)變將在再生醫(yī)學(xué)研究中有重要 的意義，下面是小編搜集整理的一篇探究雞蛋白提取液對體外培養(yǎng)千細胞蛋 白影響的論文范文，歡迎閱讀參考。 有文獻報道動物的卵細胞提取液能重新編程體細胞，包括豬的卵細胞[1 ]和非洲爪蟾的卵細胞

[2, 3]提取液都能使體細胞核重編程。在這個研究中, 我們用雞蛋白提取液作用于不同細胞，共培養(yǎng)3d后，收集細胞，送公司做干 細胞蛋白芯片檢測，現(xiàn)將研究報道如下。

1材料與方法 細胞來源 

4種細胞為我們實驗室經(jīng)常培養(yǎng)的細胞，C57小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(C 57-BMSC) (自己制備),樹駒的臍帶間充質(zhì)干細胞(TS-UC- MSC) (自己制備), 293T細胞(購上海科拉曼有限公司)和GFP慢病毒轉(zhuǎn)染成 功的293T細胞(293T-GFP) (自己轉(zhuǎn)染成功)

 雞卵清提取液的制備 取幾個雞卵，無菌分離卵清和卵黃，卵清按1 : 1加裂解液，充分攪勻, . 存放于- 20C。凍融3次后，離心，取上清，4C保存。裂解液配方: 50mmol/LNaCl, 5 mmol/LMgCl2, 100mmol/LHEPES, , 1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT), /L苯甲基磺酰氟( PMSF)和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。獲得的提取液 用50%的終濃度與293T細胞共培養(yǎng)3d,然后用定量PCR的方法檢測細胞多能基 因0CT4和NANOG與對照(培養(yǎng)基培養(yǎng))相比明顯升高，即為質(zhì)控指標合格，可 用于下面的實驗。

 

干細胞蛋白芯片檢測步驟 

 

      每個芯片孔中加入100μ l的1×封閉液，室溫搖床上孵育30min, 避免產(chǎn)生氣泡;抽去封閉液，每個孔中添加100μ1樣品， 一個陣列一個樣 品;4C振蕩過夜孵育。使用ThermoSci entificWel lwashVersa芯片洗板機清 洗玻片，每孔加入70μ 1生物素標記抗體;室溫震蕩孵育1^ 2h, 清洗，每孔 加入70μ1的1500倍稀釋的熒光劑- 鏈霉親和素，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育 12h.清洗，采用激光掃描儀例如AxonGenePix掃描信號。采用芯片分析軟件 提取數(shù)據(jù)，對于Foldchange,選取大于為有統(tǒng)計學(xué)意義。

 

檢測多能標志

 

    蛋白0CT4和NANOG兔抗人0CT4多克隆抗體購自Immunoa- way公司，鼠抗人NANOG單克隆抗體購自Millipore公司，二抗均購自碧云天 生物技術(shù)有限公司。293T細胞在6孔板中，一孔加培養(yǎng)基，一孔加50%終 濃度 的雞蛋白提取液，共培養(yǎng)3d后，用碧云天的IP細胞裂解液提細胞蛋白，取50 μ l細胞蛋白液加10μ l6×的上樣緩沖液，100C 水浴5min,上樣20 μl,進行SDS- PAGE電泳，電泳結(jié)束后，100v電壓轉(zhuǎn)膜 1h,膜用5%脫脂奶粉的TBS封閉37°C1h , 將一抗1 : 250稀釋于2%脫脂奶粉的TBS中，37"C振搖1h, TTBS洗3次， 每次5m in,二抗1 : 200稀釋于2%脫脂奶粉的TBS中，37C振搖1h, TTBS洗3次，每次5m in, ECL顯色，用Tanon的化學(xué)發(fā)光成像儀檢測發(fā)光條帶。

 2結(jié)果 

      有3個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變S0X17、BMPR- 1A和NANOG是干細胞中表達的蛋白，當體細胞向干細胞轉(zhuǎn)變后細胞中這幾個 蛋白的表達升高，我們用50%終濃度的雞蛋白提取液與C57-BMSC共培養(yǎng)3d后，這幾個蛋白的表達明顯升高，說明C57- BMSC又向更多能的干細胞分化了，見圖1.

有1個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變BMPR- 1A是干細胞多能性的標志，TS-UC- MSC用50%雞蛋白提取液共培養(yǎng)3d后，與未加雞蛋白提取液培養(yǎng)的細胞相比， BMPR-1A明顯升高，說明細胞又向多能干細胞的方向分化了，見圖2. 有1個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變BMPR- 1A是干細胞多能性的標志，293T細 胞是標準的體細胞株，用50%雞蛋白提取 液共培養(yǎng)3d后，BMPR- 1A表達明顯升高，說明293T細胞有向干細胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象發(fā)生，

見圖3.

 有1個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變0CT4是千細胞多能性的標志，293T- GFP用50%的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后，對比培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞0CT4的表達明顯 增加，說明細胞有向干細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。 細胞0CT4和NANOG蛋白的Westernblot結(jié)果(圖5)0CT4和NANOG蛋白是干細 胞多能性的標志，293T細胞用50%的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后，0CT4和NANOG蛋 白的表達量明顯增加(圖5和表1),與對照組(培養(yǎng)基培養(yǎng))相比有統(tǒng)計學(xué)意義( P<, n=3)

3討論

 S0X17、BMPR- 1A、NAN0G和0CT4是 千細胞中表達的蛋白，在細胞轉(zhuǎn)化為多能的干細胞時， 這幾個蛋白的表達明顯升高。因此，這些蛋白在細胞中表達明顯升高時，可 以認為細胞向多能的干細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。我們用共培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)加了50%雞蛋 白提取液的細胞有- -些千細胞蛋白表達明顯升高， O無識別結(jié)果胞提取液誘 導(dǎo)體細胞核重編程的方法，通常用可逆滲透法，即先用鏈球菌溶血素0(SL0)在細胞膜上打孔，再用卵細胞提取液滲透，最后再用氯化鈣再封合細胞膜上 的孔，是否這種方法誘導(dǎo)效率更高，需要今后的實驗進- - -步深入研究。

 

我們在實驗中用了4種細胞，C57 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(C57- BMSC)、樹駒的臍帶間充質(zhì)干細胞(TS-UC- MSC)、293T細 胞(購自中國科學(xué)院昆明細胞庫)和GFP慢病毒轉(zhuǎn)染成功的293T 細胞(293T- GFP),用50%的雞蛋白提取液共培養(yǎng)3d后，均檢測到了干細胞相關(guān)蛋白表達的 升高，說明了雞蛋白提取液有誘導(dǎo)細胞向多能干細胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，因為多能 標志蛋白有意義地升高了。

 對比豬卵提取液和蟾蜍卵提取液，雞蛋白提取液獲取更方便，獲取量更 大，提取過程注意無菌操作，獲得的雞蛋白提取液無須過濾除菌就可用于細 胞培養(yǎng)，有較大的應(yīng)用價值。在我們以前的研究中，發(fā)現(xiàn)雞蛋白提取液有促 細胞增殖的作用[4, 5],還有促進多能因子0CT4和NANOG升高表達的作用[6, 7] ,因此在本研究中我們進- - 步應(yīng)用干細胞蛋白芯片檢測更多的多能因子，同 時使用4種細胞，都檢測到其中多能因子的升高表達，C57- BMSC有S0X17、BMPR- -1A和NANOG這3個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，TS-UC- MSC有BMPR- -1A蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，293T有BMPR- 1A蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，293T- GFP有0CT4蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，進一步驗證了雞蛋白提取液有誘 導(dǎo)體細胞向多能細胞轉(zhuǎn)變的作用。

 

由于C57-BMSC和TS-UC- MSC是間充質(zhì)干細胞，它們經(jīng)過誘導(dǎo)后多能因子進- -步升高表達，是否證明 了雞蛋白提取液含有某些逆向分化細胞的特殊物質(zhì)，以及這些物質(zhì)的鑒定和 分離提取還有待實驗進一步驗證。

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