黑曲霉液體發酵桔粉產纖維素酶的研究

摘要：以桔粉為原料，以黑曲霉(Aspergillus niged為發酵菌株， 采用液體發酵法生產纖維素酶。通過 單因素試驗考查了麩皮和蛋白胨的比例(CN 、裝液量及接種量3個因素對產酶的影響，并在此基礎上, . 通過正交試驗確定了發酵產酶的工藝條件為:添加桔粉80g/L,麩皮和蛋白胨質量比1:2.250mL三角 瓶裝30mL Mandels氏營養液、接種量3mL，于30C下培養72h,纖維素酶產量達到1885.71U/go

 關鍵詞桔粉: 黑曲霉:液體發酵:纖維素酶

 

纖維素酶是具有降解含有β-1,4糖苷鍵的纖 維素的一組酶的總稱，廣泛應用于釀造果汁與蔬 菜加工、糧食加工、飼料、造紙、中草藥有效成 t 分的提取、紡織、采油工程、廢水處理以及能源 制造等各個方面。我國是柑桔生產大國，每年都 會產生很大- -部分落果和滯銷果，這部分廢棄柑 桔一般都是直接扔棄，既浪費了資源，又污染了 環境。. 柑桔富含果膠、纖維素、可溶性糖及多種維 生素和礦物元素，是一種良好的微生物生長基質。黑曲霉是公認安全(CRAS 的微生物，用 其生產酶制劑安全、可靠，不產生毒素，而且生 長快、發酵周期短，具有明顯的優越性。利用黑 曲霉液體發酵柑桔產纖維素酶目前未見報道。本 文通過黑曲霉液體發酵桔粉產纖維素酶的研究， 旨在為纖維素酶的液體發酵生產提數據參考，也 為廢棄柑桔的綜合利用開辟新的途徑。

材料與方法

 1.1 材料

 桔子落果，本地桔園獲得，無腐爛，將其烘 干磨成粉末，備用。 黑曲霉(Aspergilus nge) :

本院微生物試驗室保藏。

 

1.2 培養基 

1.3.1 營養液 Mandels氏營養液。

 1.3.2 斜面培養基. PDA培養基:馬鈴薯(去皮200g, 葡萄糖 5g, KHPOlg水1000mL，自然pH，瓊脂5go 1.3.3發酵 產酶培養基 產纖維素酶基礎培養基:柑桔粉80g/L，其 他組分按照單因素試驗方案進行配置，pH 6.5。 搖瓶發酵培養基:將培養好的新鮮產孢子斜 面.上的孢子制備成孢子懸液，按培養基體積10% (約1.2*10*個孢子)接種到產纖維素酶基礎培養 基中，于30 C、200r/ min振蕩培養72 h。 1.4 主要試劑

.二硝基水楊酸(DNS 試劑:取酒石酸 鉀鈉182g,溶于500 mL蒸餾水中，加熱。于熱溶 液中依次加入-二硝基水楊酸6.3g,氫氧化 鈉10g，苯酚5g，無水亞硫酸鈉5 g攪拌至溶 解，冷卻后用蒸餾水定容至1000 mL，混勻，過 濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置72 h后使用。

 檸檬酸緩沖液(pH 4.8，0.05 mol/D:取 40mL 0.lmol/L 檸檬酸與60 mL 0.1 mol/L檸檬 酸三鈉混合，再加200 mL蒸餾水稀釋- -倍。

1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 溶液:稱取. 1 g羧甲基纖維素鈉，精確至1 mg， 緩緩加入pH 為4.8的檸檬酸緩沖液80 mL,水浴加熱至全部溶 解。

攪拌均勻，冷卻后定容至1000mL,再用二層 紗布過濾。此溶液在4 C冰箱貯存，有效期為3d。 1g/100mg葡萄糖標準貯備溶液:稱取預先 于(103士 D C下干燥至恒重的葡萄糖1.000 g, . 用蒸餾水溶解后定容至100mL,即為1g/100 mL濃度的葡萄糖標準溶液。

1.5 方法 1.5.1 纖維素酶活力測定 采用DNS法。 1.5.2 葡萄糖標準曲線的制作 分別配制0μg/mL、200μg/ mL、400 g/ mL、 600μg/mL、800μg/ mL、1 000μug/ mL、1 200μg/ mL 標準葡萄糖使用溶液，各吸取0.50 mL于試管中， 同時分別吸取檸檬酸緩沖液1.5 mL、DNS試劑 3.0mL于上述試管中，混勻。將試管置于沸水浴 中，反應7 min，取出，迅速冷卻至室溫，準確 加入蒸餾水10mL,混勻。用10mm比色杯，以 空白管(對照液)調儀器零點，在分光光度計 1=540nm處測吸光度。以葡蔔糖質量濃度為橫坐 標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線 性回歸方程。相關系數R2應在0.9990以上時方 可使用(否則須重做)。

 

2結果與討論 2.1 葡萄糖標準曲線 按1.5.2中的方法繪制葡萄糖標準曲線，得回歸方程: D 0) =0.000 2ρ+ 0.0402，R=0.999 6。 標準曲線見圖1。

由圖1可知，相關系數R2為0.9996，大于 0.9990，說明回歸方程擬合良好，因此可以使用 該葡萄糖標準曲線。

 2.2麩皮和蛋白胨的質量比 CMD對產酶的影響 將麩皮(輔助碳源與蛋白胨 (氮源按不 同質量比混合成同質量濃度(6 g/ mL固形物 的培養基。取30 mL Mandels 氏營養液于250 mL 三角瓶中，做7次試驗，加入麩皮與蛋白胨不同 質量比的混合物，分別為0:6、1:5、 1:2、 1:1、 2:1. 5: 1. 6:0，然后置于30 C下振蕩培養. 72 h,收獲后測定酶活力。麩皮與蛋白胨的質量 比對纖維素酶產量的影響見表1。

2.3裝液 量對產酶的影響 

在250 mL的三角瓶中分別加入20 mL、30 mL、 40mL、50mL、60mL的Mandels氏營養液(發酵 液)，按80g/ L加入桔粉、按6g/ 100 mL加入 麩皮及蛋白胨組成培養基，并接入等量的孢子， 置于30 C下振蕩培養72 h，收獲后測定酶活力。 不同裝液量對黑曲霉產纖維素酶的影響見圖2。

 

圖2表明，裝液量30 mL黑曲霉產纖維素酶 的產量最高。由30mL至60mL來看，隨著裝液 量的增加，酶活力減少，說明黑曲霉的生長和產 酶的多少都與通氣量有很大關系:裝液量為20 mL 時酶活力比裝液量為60mL時的要高，這是因為 發酵培養過程中-直處于恒溫狀態，會導致部分 失水，所以對發酵過程造成一定的影響。因此最 佳裝液量選擇30 mL。

 2.4 接種量對產酶的影響 

分別在裝好桔粉和麩皮蛋白胨混合物的250 mL 三角瓶中加入30 mL Mandels 氏營養液，再分別 接入1.5mL、3mL、4.5 mL、6mL、7.5 mL種子 液，然后置于30 C下振蕩培養，進行發酵培養. 72 h,收獲后測定酶比活力。接種量對產酶的影 響如圖3所示。

由圖3可知，當接種量為Mandels氏營養液 體積的10%時，黑曲霉的產酶量最高:接種量大 于15%時，酶活力開始下降。這說明在一定的環 境條件下，底物量- -定時，微生物種群達到- - 定 數量將會對其本身產生抑制作用，對其生長和產 酶都有- -定程度的不利影響，故選擇10%接種量 為佳(即接種量為3 mD。 2.5發酵培養 基優化正交試驗 在單因專 美治甄產電的研究基礎上，以發 無識別結果 醇培養基的裁皮和金白胨質量比、裝液量及接種量3因素作為影響黑曲霉發酵生產纖維素酶的主 要的因子，設計3因素3水平的正交試驗，采用 L,(39表，因素水平設計見表2,試驗結果見表3。

極差分析表明， 各因素對產酶影響的主次順 序為: A>C>B, 最優水平為ACB，即麩皮和蛋 白胨質量比為1 : 2,接種量為3 mL,裝液量為30 mL。此方案在正交試驗范圍內，此條件下所 得酶活力為1 885.71 U/go 

3結論

 以黑曲霉為試驗材料，采用液體發酵法，考 察發酵桔粉產纖維素酶的培養條件。結果表明: 添加柑桔粉80g/L、麩皮和蛋白胨質量比為1 :2 (6 g/ 100 g固形物D、250 mL三角瓶裝30 mL Mandels氏營養液、接種量3 mL,于30 C下培養 72 h,纖維素酶產量達到最高。研究表明，黑曲 霉可作為纖維素酶生產的優良菌種。

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