[摘要]目的

探討煙酰胺對中波紫外線(UVB) 致豚鼠皮膚色素沉著的抑制作用。方法以亞紅斑劑量 UVB照射豚鼠背部10天建立皮膚無急性損傷色素沉著動物模型后，外涂基質和2.5%、5%、10%的煙酰胺4周，在此期間觀察膚色改變和測定皮膚L值。涂藥結束后取材，進行Masson - Fontana、冰凍切片Dopa染色和黑素細胞超微結構觀察，觀察黑素細胞數量、形態和功能的改變。結果涂抹5%煙酰胺4周后，豚鼠皮膚變白，L值顯著下降，多巴陽性黑素細胞數及黑素含量指數較對照組明顯減少(R0.05) 。結論5% 煙酰胺對UVB誘導的色素沉著有明顯的抑制，它主要是通過抑制黑素細胞的增殖和黑素細胞內黑素小體的合成而發揮作用。

[關鍵詞]煙酰胺:色素沉著:黑 素細胞

 

煙酰胺是近年來嘗試用于美白和防曬化妝品中的一種化學物質 [1，2] ，

但對其效果和作用機制了解甚少。在國內，我們曾應用原代培養的人皮黑素細胞，探討了煙酰胺抑制黑素合成的適宜濃度[3]，為進一步明確煙酰胺對皮膚色素沉著的抑制作用，本文以棕黃色豚鼠無急性損傷UVB致黑模型評價煙酰胺對皮膚色度的影響，并探討了可能的作用機制。

1材料與方法

1.1 實驗動物 體重(355土12)g， 健康成年雌性Hartley棕黃色豚鼠10只(上海銀根動物養殖場)。

1.2 受試物carpobol基質;將煙酰胺(分析純，中國醫藥上海試劑供應站)溶于carpobol中分別配成2.5%，5%、10%三種濃度。

1.3

動物模型在豚 鼠背部選定4cmX4cm區域脫毛后用TL12Rs型UV-B燈管(Philips 公司)按照16. 5mJ/d劑量照射10天，輻照總量為165mJ。照射結束后將產生豚鼠背部皮膚分為4個相離區域，分別外涂carpobol基質、2.5%、5%、10%煙酰胺，每日2次，共計4周。每周用Lab色度儀(CM508d，Minolta 公司)測定動物受試皮膚區域L值，涂藥結束后，以Powershot S45 數碼相機(Canon 公司)攝影，然后在涂藥部位取皮膚做組織學檢查。

1.4 肉眼觀察實驗期間，每日觀察豚鼠皮膚的不良反應，如紅斑、鱗屑和色素沉著。

1.5 染色方法Masson- Fontana染色:按常規方法固定、脫水包埋、脫蠟后，入氫氧化銀氨溶液作用12~ 18h后分別經0.2%氯化金水溶液、5%硫代硫酸鈉液處理數分鐘。結果:黑素顆粒呈黑色。冰凍切片Dopa染色:新鮮組織低溫恒冷切片于0.1%多巴染液中37°C孵育2h，水洗并淺染蘇木素、曙紅液。結果:活性黑素細胞呈棕黑色。

 

1.6 組織學觀察

1.6.1 多巴陽性細胞計數 在高倍顯微鏡下(日本Olympus公司)，以單盲法計數Dopa切片中每平方毫米表皮基底層所含活性黑素細胞數。

1.6.2 黑素含量指數(melanin content index， MCI) 使用IMS細胞圖

像分析系統(上海申騰信息技術有限公司)。選擇Masson-Fontana切片10處

表皮，測定黑素顆粒面積占該處表皮總面積的百分比均值。

1.6.3 電鏡觀察在電子顯微鏡下，觀察黑素細胞超微結構變化。

1.7 統計學方法采用SPSS 11.0統計軟件包處理數據，結果用(x士s)

表示。用單因素方差分析，組間兩兩比較采用St udent -Newman-Keuls法。

2結果Jlinchutoul .com..

2.1皮膚外觀觀察豚鼠背 部皮膚在按16. 5mI/d低劑量UVB重復照射10天期間，未見皮膚潮紅、紅斑或皮屑等皮膚急性損傷反應，照射14~17天色素沉著達到高峰。涂抹受試物后，豚鼠皮膚均未出現刺激反應。實驗結束時，各組皮膚均有不同程度的色素淡化，而5%濃度組皮膚色素淡化最為明顯。

 

2.2 皮膚色度L值改變Lab儀測定的色度L值是皮膚黑度的量化指標，L值越高說明皮膚越白。皮膚L值變化(OL=L 用藥后-L用藥前)隨時間改變，。用藥2周時，涂抹基質的皮膚由于UVB的滯后致黑作用L值下降了4.32，而5%煙酰胺組皮膚L值無明顯降低，兩組具有統計學差異(R<0.05) ;用藥4周結束時，基質皮膚L值下降了2.88，而相應的5%煙酰胺組皮膚較用藥前L值上升了2.03 (R<0.01) ，10%煙酰胺組皮膚L值則上升了1.67 (R<0.001)。

2.3光鏡觀察見表1。多巴陽性細胞計數和黑素含量指數的結果表明:與基質組比較，5%和10%煙酰胺可以減少表皮基底層黑素細胞數(R<0.05) ,同時可抑制黑素含量(R<0.05)。但與5%和10%煙酰胺對黑素細胞和黑素合成的抑制作用差異無顯著性。

 

2.4 電鏡觀察見圖3。基質組皮膚黑素細胞細胞膜完整，胞漿內充斥大量成熟II、IV 期黑素小體和少量1、II 期黑素小體，但細胞器較少; 2. 5%煙酰胺組，黑素小體數量略微減少:在5%煙酰胺組皮膚中，粗面內質網、線粒體等細胞器豐富，II、 IV期黑素小體明顯減少，散在分布于胞漿中; 10%煙酰胺組黑素小體分布與5%煙酰胺組近似。

 

3討論.

煙酰胺與煙酸統稱為維生素P P (維生素B 3)，是輔酶1、II 的重要組

成部分，在生物氧化過程中起遞氫作用，促進生物氧化和組織新陳代謝[4]。研究表明煙酰胺具有抗炎活性，能促進紫外線等誘導的DNA損傷修復，抑制UVB輻射的光致癌性，在臨床上早已被廣泛用于糙皮病、持久性隆起紅斑、痤瘡等皮膚病[5] 。近年煙酰胺的延緩皮膚衰老和美白功能也開始受到重視，國外已有在防曬劑中加入煙酰胺來達到防曬效果[1]。煙酰胺是在光線，空氣中性質最穩定的水溶性維生素，而且對皮膚刺激最小[5]。毒理實驗發現其小鼠經口LD50為(2.5~3.5) g/kg, 大大超過臨床使用劑量，而“三致”實驗均為陰性，現已被美國FDA認作安全藥物[4] 。Franz做煙酰胺經皮吸收研究發現其平均彌散百分數為11% [4]。以上優點說.明煙酰胺外用有減少色素沉著可能，關鍵在于煙酰胺是否有減輕色素沉著的效果。

煙酰胺是在光線，空氣中性質最穩定的水溶性維生素，而且對皮膚刺激最

小[5]。毒理實驗發現其小鼠經口LD50為(2.5~3.5) g/kg,大大超過臨床

使用劑量，而“三致”實驗均為陰性，現已被美國FDA認作安全藥物[4] 。

Franz做煙酰胺經皮吸收研究發現其平均彌散百分數為11% [4] 。以上優點說

明煙酰胺外用有減少色素沉著可能，關鍵在于煙酰胺是否有減輕色素沉著的效

果。

由于棕黃色豚鼠體內黑素細胞、黑素小體在毛囊、表皮的分布類似于人體(尤其是亞洲人)中的分布，其致黑模型應用最為廣泛[3, 6]。不過，現有的紫外線誘導色素沉著的動物模型在建模過程中，多以大于最小紅斑劑量(MED)的UVB在短期內連續照射，皮膚紅斑、蛻皮等皮膚損傷難以避免[3，6]。人體的自然曬黑過程通常不伴肉眼可見的皮膚損傷，因此為更好地模擬人體致黑情況，本文采用小劑量多次重復UVB照射致黑動物模型，在照射過程中，豚鼠皮膚無潮紅、紅斑、脫屑等急性損傷。用藥期間，涂抹基質的皮膚于用藥1周時，L值降至最低(圖2)，皮膚黑度達到最高峰，隨后L值逐漸回升，其余三個煙酰胺濃度組的L值變化也呈現相似的趨勢。用藥2周時，5%煙酰胺已開始抑制皮膚的色素沉著:用藥4周實驗結束時，涂抹5%煙酰胺與10%煙酰胺皮膚L值已經大于用藥前L值，美白

效果十分明顯，只是這2個有效濃度引起的皮膚L值改變差異無顯著性。肉眼觀察和通過圖像分析法對Masson-Fontana染色切片黑素含量的測定分析結果與用藥后皮膚L值改變情況相符，從不同角度說明了煙酰胺具有較為肯定的美白效果。皮膚色素沉著程度主要決定于以下幾個因素: (1) 酪氨酸酶、多巴色素互變酶(TRP-2) 、二羥基吲哚羧酸氧化酶(TRP- 1)等活化調節黑素細胞內黑素合

成: (2) 黑素細胞增殖: (3) 黑素小體向角質形成細胞的轉運和降解: (4)角質形成細胞的新陳代謝速度等。通常，美白劑都是通過影響上述-一個或多個因素發揮作用。

 

目前，學術界對于煙酰胺是否能抑制黑素細胞增殖存在爭議:日本學者T.HAKOZAKI等[1]認為煙酰胺對黑素細胞增殖沒有影響:帕它木等[7]以不同濃度煙酰胺處理人皮黑素細胞發現隨煙酰胺濃度增加、作用時間的延長，抑制黑素細胞的增殖作用明顯增強。但現有的關于煙酰胺美白機制的探討都局限在細胞水平，離體細胞畢競不能反映人體的全部特征，從細胞外推到人體，需要一個很重要的步驟一動物實驗。本次動物實驗對涂抹煙酰胺的皮膚組織活檢Dopa染色的結果顯示5%和10%煙酰胺均可明顯減少位于表皮基底層的、具有黑素合成功能的活性黑素細胞數。由于在紫外線輻射下，角質形成細胞分泌的細胞因子對于黑素細胞的功能狀態影響較大，如Imokawa等[8]研究發現紫外輻射誘導表皮中IL-1增多，IL-1 可以促進角質形成細胞中內皮素的釋放，而內皮素反過來又可促進黑素細的分裂增殖，所以，即使離體細胞結果與本次動物實驗結果有差異，考慮是由于角質形成細胞和黑素細胞間的相互作用引起的。此外，有研究表明煙酰胺在體外和活體都可以抑制活性氧族(ROS)的形成[9]，也有研究表明由紫外線輻射誘導產生的ROS [10]，并促進表皮黑素細胞的黑素合成[11]，因此煙酰胺也可能通過抑制黑素細胞內的黑素合成發揮作用。于是，本文在透射電鏡下觀察用藥4周皮膚組織超微結構的改變，結果表明與基質組皮膚相比，外用5%煙酰胺的皮膚表皮黑素細胞中II、IV 期黑素小體明顯減少。因此考慮抑制黑素細胞也是煙酰胺的作用途徑之一。總之，外用煙酰胺對紫外線致黑的豚鼠皮膚有明顯的抑制色素沉著的作用，5%的煙酰胺為適宜添加濃度，它的美白效果主要是通過抑制黑素細胞的增殖和黑素細胞內黑素小體的合成發揮作用。

 

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